常用生物染色劑--考馬斯亮藍(lán)
瀏覽次數(shù)：8347發(fā)布日期：2012-07-09
考馬斯亮藍(lán)有G250和R250兩種，在顏色索引（Colour Index）中給出了不同的編號(hào)（42655和42660）。亮藍(lán)G和亮藍(lán)R在冷水中分別為微溶和不溶，在熱水和乙醇中分別為可溶和微溶。兩種染料均能對(duì)固定的蛋白進(jìn)行有效地染色，使用濃度為溶于甲醇:冰醋酸:水（50:10:40）的0.05%溶液。考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，是常用的蛋白染料，染色后為藍(lán)綠色，常用來(lái)作為蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)R250與蛋白質(zhì)結(jié)合雖然比較緩慢，但是燃料可以穿透凝膠，染膠效果好，染色后為紅藍(lán)色，且可以被洗脫下去，所以可以用來(lái)對(duì)電泳條帶染色。G250也可染膠，但染色過(guò)程慢且染色后背景高，脫色困難。
考馬斯亮藍(lán)R250（Coomassie brilliant blue R-250）為三苯基甲烷（triphenylmethane），每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3-H基團(tuán)，本身偏酸性，磺酸基與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)結(jié)合形成染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物。MW=824，λmax=560-590nm。考馬斯亮藍(lán)R-250是通過(guò)范德瓦爾鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，可以被洗脫下去，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色，染色靈敏度比氨基黑高5倍。它與不同蛋白質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)出基本相同的顏色，并且在比較寬的范圍內(nèi)（15-20g），掃描峰的面積與蛋白量呈線性關(guān)系。但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時(shí)，對(duì)高濃度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析時(shí)要注意這點(diǎn)。
考馬斯亮藍(lán)G250（Coomassie brilliant blue G-250）為二甲花青亮藍(lán)（xylene cyanine brilliant blue），是一種甲基取代的三苯基甲烷。比考馬斯亮藍(lán)R250多二個(gè)甲基，MW=854；λmax=590-610nm，游離狀態(tài)下呈紅色。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其優(yōu)點(diǎn)在于它在三lvyisuan中不溶而以膠體形式存在，能選擇性地和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，染色迅速，著色深的蛋白質(zhì)區(qū)帶在數(shù)秒內(nèi)即可顯現(xiàn)出來(lái)，約45分鐘后著色zui深，成本低，重復(fù)性好。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有zui大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1,000μg/mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。
考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量流程
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過(guò)0．2％影響測(cè)定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford濃染液的配制：將100rug考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50m1 95％乙醇，加入100ml濃磷酸，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至200ml，此染液放413至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。
2．標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測(cè)定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3．將待測(cè)樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同（用PBS）。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾除去。
5．每個(gè)樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30rain。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過(guò)30min．
6．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。
考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無(wú)法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無(wú)礙。
考馬斯亮藍(lán)R-250是電泳的
考馬斯亮藍(lán)G250和R250都可以染蛋白，一般用R250，G250染色后背景較深不易脫色。 一般R250 染蛋白，G250 一般測(cè)蛋白濃度，也可染膠，敏感性更高但較慢脫色較難。
考馬斯亮藍(lán)G250常用的蛋白染料，作定性試驗(yàn)用,染色后為藍(lán)綠色;R250較敏感,做定量實(shí)驗(yàn)用,染膠效果較好.染色后為紅藍(lán)色 。
